數(shù)字PCR技術的原理
數(shù)字PCR（DigitalPCR-dPCR）技術是一種新的核酸檢測和定量方法，與傳統(tǒng)定量PCR（qPCR）技術不同，數(shù)字PCR采用定量的方式，不依賴于標準曲線和參照樣本，直接檢測目標序列的拷貝數(shù)。由于這種檢測方式具有比傳統(tǒng)qPCR更加出色的靈敏度和特異性、精確性，dPCR迅速得到廣泛的應用，這項技術在極微量核酸樣本檢測、復雜背景下稀有突變檢測和表達量微小差異鑒定方面變現(xiàn)出的優(yōu)勢已被普遍認可，而其在基因表達研究、microRNA研究、基因組拷貝數(shù)鑒定、癌癥標志物稀有突變檢測、致病微生物鑒定、轉基因成分鑒定、NGS測序文庫精確定量和結果驗證等諸多方面具有的廣闊應用前景已經(jīng)受到越來越多的關注。
數(shù)字PCR采用的策略概括起來非常簡單，就是“分而治之”（divideandconquer），這種做法非常類似于計算機科學中的“分治算法”，將一個標準PCR反應分配到大量微小的反應器中，在每個反應器中包含或不包含一個或多個拷貝的目標分子(DNA模板)，實現(xiàn)“單分子模板PCR擴增”，擴增結束后，通過陽性反應器的數(shù)目“數(shù)出”目標序列的拷貝數(shù)。在實際的數(shù)字PCR實驗中，事實上是通過呈現(xiàn)兩種信號類型的反應器比例和數(shù)目進行統(tǒng)計學分析，計算出原始樣本中的模板拷貝數(shù)。
數(shù)字PCR可以直接計算目標序列的拷貝數(shù)，因此無需依賴于對照樣品和標準曲線就可以進行精確的定量檢測；此外，由于數(shù)字PCR在進行結果判讀時僅判斷有/無兩種擴增狀態(tài)，因此也不需要檢測熒光信號與設定閾值線的交點，*不依賴于Ct值的鑒定，因此數(shù)字PCR的反應受擴增效率的影響大大降低，對PCR反應抑制物的耐受能力大大提高；數(shù)字PCR實驗中標準反應體系分配的過程可以極大程度上降低與目標序列有競爭性作用的背景序列濃度，因此數(shù)字PCR技術也特別適合在復雜背景中檢測稀有突變。
數(shù)字PCR技術的發(fā)展歷史
從以上介紹我們可以看到，事實上數(shù)字PCR與傳統(tǒng)的定量PCR兩者皆定位于同樣的平臺基礎——聚合酶鏈式反應和雙鏈DNA標記技術，但兩者采用的是*不同的定量策略和思想方法，dPCR和qPCR并沒有實驗方法和思路上的承繼關系，從這個角度來說，目前很多人把數(shù)字PCR稱為第三代PCR技術并不準確。
在實時定量PCR技術成熟和發(fā)展之前，早在1992年，南澳洲弗林德斯醫(yī)學中心的科學家使用有限稀釋、PCR和泊松分布數(shù)據(jù)校正模型的方法（limitingdilution,PCRandPoissonstatistics），檢測了復雜背景下低豐度的IgH重鏈突變基因，進行了極其精細的定量研究，雖然當時這種方法并沒有被冠以“數(shù)字PCR”之名，但已經(jīng)建立了數(shù)字PCR基本的實驗流程，更重要的是了數(shù)字PCR檢測中一個極其重要的原則——以“終點信號的有或無”（all-or-noneendpoint）作為判斷標志，這也是之后1999年BertVogelstein和KenKinzler將之命名為“數(shù)字PCR”(digitalPCR)的主要原因。
數(shù)字PCR技術的原理非常簡單，然而在樣品分散（divide）的環(huán)節(jié)上卻遇到了無法突破的瓶頸。早期的dPCR嘗試使用96孔板到384孔板甚至1536孔板作為分散反應的載體，或者采用類似流式技術的磁珠乳液擴增方法(BEAMing-Beads,Emulsion,Amplification,Magnetics)，2006年Fluidigm公司推出了臺商品化的基于芯片的商品化數(shù)字PCR系統(tǒng)。2008年德國Inostics推出基于磁珠法乳濁液擴增和流式檢測方式的BEAMingdPCR檢測服務，但這些方法無論在分散程度和數(shù)據(jù)群體的體量上都無法達到更加精細的要求，時間和耗材成本嚴重限制了dPCR技術的發(fā)展。
近幾年來，隨著納米制造技術和微流體技術（nanofabricationandmicrofluidics）的發(fā)展，數(shù)字PCR技術遇到了突破技術瓶頸的佳契機。1997年Kalinina,、BrownJ,和SilverJ使用納升級芯片進行單克隆模板PCR擴增，獲得了美國，更重要的是這種采用“電浸潤法”進行納升級芯片制造技術顯露雛形。伴隨二代測序技術發(fā)展起來的“油包水PCR”技術，可以一次生成數(shù)萬乃至數(shù)百萬個納升甚至皮升級別的單個油包水微滴，可以作為dPCR的樣品分散載體。
QuantaLife利用油包水微滴生成技術開發(fā)了微滴式數(shù)字PCR技術，這也是早出現(xiàn)的相對成熟的數(shù)字PCR平臺，在運行成本和實驗結果穩(wěn)定性方面都基本達到了商品化的標準。2011年，QuantaLife公司被Bio-Rad公司收購，其微滴式數(shù)字PCR儀產(chǎn)品更名為QX100型號儀繼續(xù)在市場上銷售，這個早期型號為dPCR概念的普及和應用領域的拓展發(fā)揮了重要作用。2013年該公司又推出了升級型號QX200。
2012年，RainDance公司推出Raindrop型號數(shù)字PCR設備，這個設備將其原有的二代測序文庫制備平臺技術平移到數(shù)字PCR技術平臺，在高壓氣體驅動下，將每個標準反應體系分割成包含100萬至1000萬個皮升級別微滴的反應乳液，該公司的創(chuàng)始人之一DarrenLink表示這種超高的微滴數(shù)目可以為用戶“提供更高的檢測動態(tài)范圍，適用于處理更大濃度差異的不同樣品”。
2013年下半年，Life-technologies推出了QuantStudio3D數(shù)字PCR系統(tǒng)，這也是目前數(shù)字PCR市場上型號的產(chǎn)品。采用高密度的納升流控芯片技術，樣本均勻分配至20,000個單獨的反應孔中。在整個工作流程中，樣本之間保持*隔離，可以有效地防止樣品交叉污染，減少移液過程，簡化操作步驟。同時芯片式設計避免了微滴式系統(tǒng)可能面臨的管路堵塞問題。
作為Life-technologies在OpenArray芯片平臺之外推出的全新的芯片式數(shù)字PCR系統(tǒng)，值得一提的是，這個全新的系統(tǒng)在設計理念上綜合考慮了系統(tǒng)穩(wěn)定性與運行成本因素，直接反映了該系統(tǒng)“適合所有分子生物學實驗室使用的數(shù)字PCR系統(tǒng)”的市場定位。
數(shù)字PCR技術的應用領域
從上世紀90年代以來qPCR技術的爆發(fā)式發(fā)展使得現(xiàn)代核酸檢測技術具有全新的面貌，而進入二十一世紀之后，速度更快、通量更高。成本更低的DNA測序技術正在迅速發(fā)展，也是目前競爭為激烈的研究領域之一，即使在這種情況下，dPCR技術仍然以其高度的靈敏性和特異性在諸多科學領域爭取到屬于自己的一席之地。即使在一些傳統(tǒng)的qPCR應用領域，也有一些實驗室同時選擇dPCR平臺進行平行實驗以保證實驗結果的準確和可重復性。
在基因組變異研究領域，群體基因組水平上的SNP（SingleNucleotidePolymorphism，單核苷酸多態(tài)性）檢測面臨的問題主要是突變序列往往與大量正常序列同時存在，競爭性反應嚴重影響突變序列的檢測精度，數(shù)字PCR技術帶來的*的擴增特異性在稀有突變檢測方面具有天然的優(yōu)勢，在癌癥標志物檢測、無創(chuàng)產(chǎn)前檢查、線粒體突變檢測等研究方向上，我們已經(jīng)看到dPCR的許多精彩表現(xiàn)。
CNV（CopyNumberVariations，拷貝數(shù)變異）研究需要*的定量精度以區(qū)別不同拷貝數(shù)之間的微小差異，測序方法適用于高于30%的變異率檢測，而qPCR的分辨在1.5倍左右，數(shù)字PCR通過直接計數(shù)目標基因與參照基因(拷貝數(shù)為1的基因，例如RNaseP)的數(shù)目，計算比值，直接得到目標基因的拷貝數(shù)可以達到*的拷貝數(shù)分辨精度。
除此之外，dPCR在病原微生物檢測、microRNA研究、基因表達研究、NGS測序文庫的定量、表觀遺傳學直接相關的DNA甲基化定量檢測、ChIP定量鑒定等領域的應用都令人極為期待，而在轉基因成分鑒定、分子標準品精確定量、環(huán)境樣本檢測等具體的應用方向上，已經(jīng)有大量實驗數(shù)據(jù)和結果證明了dPCR技術的優(yōu)良性能。
與傳統(tǒng)qPCR技術相比，數(shù)字PCR技術具有*的靈敏度、特異性和精確性，但截止目前而言，數(shù)字PCR對廣大科研工作者仍然是一種全新的檢測方法，我們在看待數(shù)字PCR的應用前景時，更應該保持一種開放的心態(tài)，與其說數(shù)字PCR技術是一個新的檢測平臺，不如把它視為一種全新的技術思路和手段，在這個平臺上必將有更多的應用幫助我們深入到分子生物學研究的更高層次。
地址：北京市通州區(qū)經(jīng)濟開發(fā)區(qū)南區(qū)漷興三街1號
郵箱：biolink2018@163.com